Kopyalama Kolaylaştı: Evrensel Bir İzotermal DNA Amplifikasyonu Tekniği
DNA kanıtı ile suç işleyenleri ortaya çıkarmak, bir patojeni tespit etmek, paleontolojik keşifleri sınıflandırmak ya da babalık testi… Nükleik asitleri çoğaltmak (amplifikasyon) vazgeçilmez bir yöntemdir. Angewandte Chemie dergisinde, araştırmacılar, alışılagelmiş ısıtma soğutma basamaklarının yanı sıra karmaşık cihazların kaçınıldığı çok daha basit, yüksek hassasiyetli ve güvenilir yeni bir tekniği tanıtmışlardır. Reaksiyon maddeleri liyofilize edilebilmektedir, böylelikle bu evrensel teknik laboratuvar ortamı dışında da kullanılabilmektedir.
En yaygın olarak kullanılan amplifikasyon tekniği polimeraz zincir reaksiyonudur (PCR). Bu teknik, yüksek enerji gerektiren özel cihazlar içerisindeki çoklu termal döngülerin tekrarına dayanır. Hastanın başucu ya da mesafeli yerler gibi laboratuvar ortamı dışında gerçekleştirmek zordur, Termal döngüler olmadan gerçekleştirilen alternatif teknikler çoğunlukla karmaşıktırlar ve yeterince hassas değildirler. Ayrıca maliyetli reaktiflere ihtiyaç duyarlar ya da açık biçimde kabul edilebilir değildirler.
Shanghai, Çin’de bulunan Doğu Çin Üniversitesi, Bilim ve Teknoloji bölümünden Bang-Ce Ye ve Bin-Cheng Yin ile çalışan araştırmacılar yeni ve daha az maliyetli bir teknik geliştirmişlerdir: Cas9n-esaslı amplifikasyon reaksiyonu (Cas9nAR). Reaksiyon, 37 °C derecedeki sabit sıcaklıkta bulunan homojen çözelti içerisinde, tek bir adımda gerçekleşmektedir.
Bu çalışmada araştırmacılar, bakterilerin “bağışıklık sistemlerindeki” bileşenleri kullanmışlardır. Bakteriler virüsler tarafından enfekte olduklarında, yabancı genetik materyali küçük parçalara bölerler ve kendi genomundaki belirli bölgelere yerleştirirler. Sonradan ortaya çıkan bir enfeksiyon vakasında, bakterideki RNA iplikleri bu sekansları “tanır” ve direkt olarak “genetik makas”a dönüşerek yabancı DNA’yı keser. Ayrıca bu araçlar modern genetik mühendisliğinde de kullanılmaktadırlar.
Yin, Ye ve onların yardımcı çalışanları, Cas9 olarak bilinen genetik makasta değişiklik yapmışlardır ve bu değişiklik ile Cas9, artık DNA’yı tamamen kesmeyecektir. Bunun yerine, sadece bir zinciri keserek, DNA zinciri üzerinde “çentik” oluşturmaktadır. Bu tip enzimler “nickaz” olarak adlandırılmaktadır. Bakteriyel sistemlerdeki gibi, Cas9 nickaz enzimi çentiğin yerini belirleyen bir RNA zincirine bağlanmaktadır. Örneğin bu RNA üretilebilmektedir ve bir patojenin karakteristik bir DNA sekansını tanıyabilmektedir. Daha sonra Cas9 nickaz enzimi, bağlandığı DNA’da bir çentik açmaktadır.
Yeni teknik için araştırmacılar, DNA’ya iki yerden çentik atabilecek iki farklı Cas9 nickaz RNA kompleksi üretmişlerdir. PCR ürünleri içerisinde kullanılan bir polimeraz (ekzo Klenow polimeraz) ilk çentikten başlayarak DNA zincirindeki bazları bağlamakta ve ikinci çentiğe kadar, çentik atılan zinciri de serbest bırakarak, parça parça tamamlamaktadır. Serbest bırakılan yeni DNA üzerinde tekrar tekrar çentikler açılmakta ve nickaz kompleksi ile tamamlanmaktadır. Bu işlemde ortaya çıkan kısa tek zincirler, ikinci bir döngüde daha fazla amplifikasyon için başlangıç sayılmaktadırlar. Polimeraza ve nickaz kompleksine ek olarak, ihtiyaç duyulan şeyler, kopyalar için başlangıç noktası olarak sadece iki adet uygun primerdir.
Bakteriyel genomik DNAların parçaları ve testler gösteriyor ki hedeflenen sekans bölgesi kusursuz olarak tanınmakta ve amplifike edilmektedir. 20 μL hacim içerisinde tek bir molekülü tespit etmek mümkündür. Bir gen içerisindeki tek bir nükleotid farklılığı, yüksek hassasiyet ile tespit edilebilmektedir.
Makaleyi görüntülemek için “Evrensel İzotermal DNA Amplifikasyonu için Bir RNA Rehberliğindeki Cas9 Esaslı Teknik” burayı tıklayın.
Kaynak: phys.org
