Organoid Hücre Atlası
İnsan organoidleri, biyomedikal uygulamalar için muazzam bir potansiyele sahip. Kültüre alınmış hücrelerin bu üç boyutlu yapıları; in vivo organ geliştirilmesi ve organların biyolojik işlevleri açısından önemli sonuçlara ulaşılmasını sağlamaktadır. Bu haritalandırma insan fizyolojisi ve patolojisinin izlenebilir bir in vitro modeli olarak görev yapar ve böylece insan (denekler) üzerinde yapılması zor ya da imkansız olan çalışmalara olanak sağlar. Örneğin; organoidler, insan biyolojisini yansıtan karmaşık bir hücresel bağlantının gözlemlenmesinde, çeşitli genetik ve farmakolojik denemelerin gözlemlenmesine ve organda hastalığın başlangıcının erken aşamalarda araştırılmasını sağlayabilir. İnsan organoidleri, preklinik ilaç geliştirme aşamalarında olduğu gibi birçok alanda da hayvan modelleri ile tamamlanır ancak bu yöntemin gelişmesi ile hayvan deneylerinin yerini alacak bir alternatif yöntem geliştirilmiş olacaktır. Ayrıca, hassas terapiler için hastaya özel ‘avatarlar’ sağlanabileceğinden kanser gibi hastalıkların tedavileri de dahil olmak üzere kişiye özel ilaç geliştirmede, nadir genetik hastalıkların tedavisinde (kistik fibroz gibi) ve karmaşık çok faktörlü hastalıkların tedavisinde(epilepsi gibi) kişiye özel tedavi geliştirilmesinde çok faydalı olacaktır. Buna ek olarak, hastalara nakledilebilecek fonksiyonel biyolojik yapılar üretmek amacıyla rejeneratif tıbba da çokça katkıda bulunabilir.
Fotoğraf-1 : a. Organoidler, belirli bir hücre soyuna, dokuya ve organa bağlı olan olgun kök hücrelerden ya da geniş bir hücre tipi kümesinin oluşturabileceği ancak daha kompleks farklılaşma adımları gerektiren pluripotent hücrelerden üretilebilir. b. İnsan organoidlerinin biyolojik işlevlerinin in vitro modellemesi, ilaçların test edilmesi ve rejeneratif tıp gibi alanlarda genel olarak faydalı. c. Temel biyoloji ve biyomedikal araştırmalarda organoid uygulamaları içerisine alır, bu alanlarda organoid araştırmalarının ilerletilmesine sebep olan zorluklar; organoidlerin karakterize edilip doğrulanması ve yeni organoid protokollerin geliştirilmesi neden olmaktadır. d.Tek hücreli canlılar üzerinde uygulanan teknolojiler; organoidler hakkında elde edilen bilgilerin sistematik olarak doğrulanmasını sağlayarak, organoid protokol gelişimini ve insan organoidlerinde oluşabilecek fonksiyonel hataların anlaşılabilmesi için yapılan deneylere yüksek çözünürlüklü bir okuma sağlayarak organoid araştırmalarının ilerlemesini sağlayabilir.
İnsan organoidlerininin tam potansiyelinin anlaşılabilmesi için öncelikle temel zorlukların ele alınması gerekli (Şekil 1c ). Hemen hemen insan biyolojisinin en güvenilir modeli olarak görülen organoidlerin daha iyi tanımlanmasına ve elde edilen sonuçların onaylanmasına ihtiyacımız var. Bu bilgilendirici, yüksek verimli profilleme için uygulanan tahlillerin yanı sıra hücrelerin bileşenlerinin, hücresel farklılaşmanın, hücrelerin durumlarının ve uyaranlara verilen yanıtların oluşturulması için gereken standartların tanımlanması gereklidir. İyi karakterize edilmiş insan organoidlerinin gelecekte geliştirilmiş bir kataloğunun, teknik ve biyolojik varyasyon kaynaklarını ölçmek için kapsamlı bir referans olcabileceğini unutmamak gerekir. Dahası, genetik olarak çeşitli örnek donörlerinde oluşturulacak sisteme dahil edilmesi, insan popülasyonundaki bireyler arası varyasyonu değerlendirmemize yardımcı olacaktır.
Organoidler için mevcut protokoller birçok uygulama için yararlı olsa da, ilgili teknik ve kavramsal sınırlamalar hala söz konusu. Örneğin, organoidler, primer doku hücrelerin çeşitliliğini (bağışıklık sistemindeki hücreleri ve stroma[organın bağ dokusundan oluşan iskeleti] gibi ve parankimal olmayan hücrelerde dahil) tam bir şekilde temsil edilemeyebilir ve çevresel etmenlerin organizmanın üzerindeki etkilerinin(yaşlanma gibi) hesaplanması şuan sahip olduğumuz tekniklerle sınırlıdır. Yeterli doku organizasyonu, farklılaşmış hücreler, vaskülarizasyon, immün hücre infiltrasyonu ve bazı organlar için (örneğin deri ve bağırsak) hatta bir mikrobiyomu dahi içeren organoidler üretebilen sağlam protokolleri geliştirebilmemiz çok önemli. Tüm bunlara ek biyolojiyi keşfetmek için organoidleri en etkili şekilde nasıl kullanabileceğimizi unutmamalıyız ve bu keşifleri yapabilmek için hala öğrenmeye devam ediyoruz.
Tek-hücre sekanslama ve boyut profillenme; bu sorunların ele alınmasında kilit bir role sahiptir (Şekil 1d). Organoidlerin ve organoid gelişiminin kapsamlı bir moleküler haritası, hücrelerin durumunu ve transkripsiyon düzenleyici programlarla benzeri görülmemiş ayrıntılarla açıklanmasını ve in vivo olarak elde edilen sonuçların gerçek insan dokularıyla karşılaştırılabilir olmaları, organoidlerin değerlendirilmesi için güçlü bir yeni yöntem sağlamaktadır. Tek-hücre epigenom ve transkriptom profillemesi; organoidlerin hücre bileşenlerini ve hücrenin durumunu nicel verilerle yüksek boyutlu bir değerlendirme ile sunar. 3D boyutlu profilleme testleri doku organizasyonunu ve yapıların 3D mimarisini karakterize edebilir. Bu yöntemler aynı zamanda organoidlerin kalite kontrolünü de geliştirir (örneğin, aykırı değerlerin belirlenmesi, eksik hücre tipleri veya anormal gen regülasyonları) ve hastalık merkezli çalışmalar için referans görevi olur. Ayrıca, organoidlerin ve uyumlu ex vivo doku örneklerinin karşılaştırmalı moleküler profillerinin elde edilmesi örneğin eksik hücre popülasyonlarının ya da organoidlerdeki hücresel farklılaşmaların sebeplerini belirleyerek, yeni ve geliştirilmiş organoid protokollerin geliştirilmesinde rehber olabilir. Son olarak, tek-hücre test teknolojisi, insan organoidlerinde test edilen fonksiyonel deneylerin, genetik veya farmakolojik bozukluklar için güçlü ve ölçeklenebilir bir okuma sağladığını da unutmamak gerekir.
İnsan organoidlerini tek-hücre teknolojisiyle birleştirmenin fizibilitesini ve faydasını görebilmek için, İnsan Hücresi Atlası (HCA) içinde tek hücre odaklı bir ‘Biyolojik Ağ’ olarak organoidlerin ve karmaşık in vitro sistemlerin hücre karakterizasyonunu içeren “Organoid Hücre Atlası”nın pilot projesini başlatmış bulunmaktayız( https://www.humancellatlas.org/coordinators). Organoid Hücre Atlası, insan organoidleri için tek-hücre ve boyutsal genomik verilerin üretimini, kalite kontrolünü, elde edilen bilgilerin yayımlanmasını ve kullanımını kolaylaştıracaktır. Bu uygulama ile elde edilen bu tür veri kümelerini HCA’da oluşturulan birincil dokuların kapsamlı profilleri ile bağlamakta mümkün. Organoid Hücre Atlası’nı kurmaya yönelik ilk adım, geçtiğimiz günlerde Avrupa Birliği Horizon 2020 çağrısı tarafından finanse edilmiştir “HCA Organoid” projesi ile bir insan hücresi atlasının temellerini inşa etmekteyiz.
HCA İçindeki Organoid Hücre Atlası
Organoid Hücre Atlası, HCA’nın temel yapı taşı olacaktır. HCA’nın insan sağlığını anlamak ve hastalıkların teşhis edilmesi, izlenmesi ve tedavi etmesi için temel olarak tüm insan hücrelerinin kapsamlı bir referans haritalamasını oluşturma misyonumuzun merkezinde yer almaktadır. İnsan Genom Projesi gibi, HCA’nın da özellikle hassas tıp ve rejeneratif biyoloji gibi alanlarda önemli biyomedikal bir etkiye sahip olması beklenmektedir. HCA insan organoidleri, birincil doku örneklerinin profillemesini fonksiyonel çalışmalar için kolayca bozulan insan dokularının bir modelle tamamlandığı ve aynı zamanda karşılaştırılabilir profillemelerden de yararlanılabildiği için büyük önem taşımaktadır.
Organoidlerde tek hücre profillemelerinin ilk uygulamaları; fare bağırsak organoidleri ve insan beyin organoidlerinin hücresel bileşiminin tek-hücre RNA sekans analizini içermektedir. Aslında yapılan diğer öncü çalışmalar karmaşık hücresel ağların varlığını ortaya çıkarmıştı ve organoid üretme protokollerini geliştirmek için tek hücre profillerinin kullanımını yaygılaştırmıştır. Yayımlanan ilk raporlara göre, organoid geliştirmenin, insan primer dokusu ve in vivo organogenez arasındaki çarpıcı paralelliklerin belirlenmesini sağladığı görülmüştü. Tüm bunlar; organoidlerin, insan biyolojisini in vitro inceleme potansiyeline sahip olduğunu gösterdi.
Tek-hücreli profilleme ve organoid teknolojileri arasındaki bu sinerjiden yararlanmak için; Organoid Hücre Atlası, Pediatrik Hücre Atlası ve İnsan Tümör Hücresi Atlas Ağı gibi diğer özel atlasların oluşturduğu bu örnekleri takiben HCA tüm bu örnek oluşumların liderliğiyle yakın bir koordinasyonla başlatılmıştır. Organoid Hücre Atlası, dört tamamlayıcı yönü takip etmektedir ve açık işbirliğine dayalı bir ağdır. Bu ağ ile ilgili birinci olarak, insan organoidlerinin tek-hücreli profillemesinin teşvik edilmesi ve standartlaştırılması; ikinci olarak, atlastaki verilere HCA veri altyapısı aracılığıyla da (aynı şekilde bilgilendirici meta verilerede erişim mümkün) erişim kolaylaştırılmıştır; üçüncü olarak, organoid profillerin primer doku verileriyle birleştirilebilmesi için çeşitli hesaplama yöntemleri ve araçlar sisteme dahil edilmiştir; son olarak, organoidlerin in vivoya benzer HCA profillerinin kullanılıp biyolojik bağlamlara yerleştirilmesi mümkün. Öngörülen veri entegrasyonu, mevcut HCA veri altyapısını geliştirip genişletecek olan Organoid Hücre Atlas Portalı adı verilen etkileşimli, açık erişimli, web tabanına dayalı bir hesaplama platformu tarafından yürütülecektir.
Ognoid Hücre Atlasının İlk Versiyonu
Avrupa Birliği Horizon 2020 (EU H2020) ile HCA Organoid projesi, önümüzdeki yıllarda daha geniş, işbirliklerine açık, küresel bir girişim için çekirdek görevi görebilecek olan Organoid Hücre Atlası’nın ilk versiyonunu oluşturmamızda bizlere bütçe sağladı. Bu pilot projede, bir insan organoid seçiminde tek hücreli transkriptom profilleri, epigenom haritaları ve ayrıntılı görüntüleme verileri oluşturuluyor. İki organ (kolon ve beyin için) normal popülasyon varyasyonunu belirlemek ve hastalık merkezli çalışmalar için bir referans oluşturmak amacıyla her biri 100 tam genom dizilimi elde edilmiş bireylerden organoidler türetip karakterize edilecek (Şekil 2a, b). Organoidler ve tek hücreli veriler; kullanıcı dostu bir erişim, organoid profilleri arasındaki karşılaştırmalar ve birincil insan dokuları için tek hücre verilerine ev sahipliği yapacak ve veri üretimine paralel olarak geliştirilen Organoid Hücre Atlas Portalı’nda kullanıcıların hizmetine sunulacak.
Fotoğraf-2 a. İnsan organoidlerinin (solda) ve insan birincil doku örneklerinin (sağda) tek hücre profili tamamlayıcı bilgiler sağlamaktadır. Organoidlerden ve birincil dokulardan gelen tek hücreli profiller arasındaki veri entegrasyonu, her yaklaşımın güçlü yönlerinin olması bizlere doğru sonuca ulaşmamızda yardımcı olur ve her iki bağlamda da aynı hücre tipinin detaylı bir araştırması mümkün kılınmış olur. b. Organoid Hücre Atlas Portalı, in vivo yöntemlerin bir muadilli olarak HCA profilleri tarafından sunulan biyolojik bağlamda insan organoidlerinden elde edilen tek hücre verilerinin analiz edilmesi ve yorumlanması için temel özelliklerin hepsine sahip olacaktır.
Bu üç nedenden ötürü HCA | Organoid projesinin iki odak noktası olarak kolon ve beyin organoidleri seçilmiştir. Bu organların seçilmesinde 3 ana neden bulunmaktadır.
1-)Projede kolon ve beyin üretilecek organoidlerin gösterildiği ilk organlar arasındaydı, dolayısıyla nispeten oturmuş(kesinleşmiş) protokoller bulunmaktaydı.
2-)Kolon organoidleri, birincil ex vivo örneklerde yetişkin kök hücrelerden üretilirken, beyin organoidleri pluripotent hücrelerden üretilmektedir, böylece iki ana organoidin üretilmesi için gereken kaynak kapsama alanı içerisindedir.
3-) Kolon ve beyin organoidleri zaten hastalık merkezli çalışmalar için kullanılmıştır ve bu organoidlerin çok sayıda bireyden elde edilmiş tek hücreli karakterizasyonu biyomedikal uygulamaları kolaylaştıracaktır.
Kolon ve beyin organoidlerine öncelikli olarak odaklanmanın ötesinde, HCA | Organoid projesi, veri altyapısının çoğunun jenerik olacak biçimde ve diğer insan organoidleri için geçerli bir şekilde kullanımı için tasarlanmıştır. Geliştiriciler organoid Hücre Atlası ile ara bağlantı veya entegrasyon olasılığının keşfedilebilmesi için farklı insan organoid türlerinde sistematik tek hücre profillemesini takip eden projelerle aktif olarak işbirliği aramaktadırlar.
Organoid Hücre Atlas Portalının geliştirilmesi, AB H2020 HCA | Organoid projesinin temel amacıdır. Bu portal insan organoidleri için tek hücreli verilerin erişimini ve analizini kolaylaştıran hesaplama altyapısı olup, web tabanlı bir ön uç sağlayacaktır. Yapılan tüm bu çalışmalar, veri gönderme, işleme, açıklama ve erişim için HCA’nın ( https://data.humancellatlas.org ) mevcut Veri Koordinasyon Platformu altyapısını temel alacaktır. Organoidlere özgü temel özellikler arasında insan organoid verilerinin interaktif keşfi, fonksiyonel deneyler için veriye dayalı organoid seçimi ve hastalığa özgü organoidlerin normal organoidlerin referansları ile karşılaştırılması da sistemde yer alacaktır.
Organoid Hücre Atlas Portalı ayrıca insan organoidlerinin tek hücre profilleri ile HCA’da bulunan ilgili birincil dokular arasında, bu veri kümeleri arasında hücre-hücre hizalamalarını etkinleştiren algoritmaları kullanarak etkileşimli eşlemeler sağlayacaktır. Bu işlevsellik, mekanistik araştırma ve ilaç geliştirme için hedef genlerin tanımlanmasının da dahil olduğu birçok alanda, organoidlerin ayrıntılı biyolojik deneyler için bir model olarak kullanılmasını kolaylaştıracak ve teşvik edecektir. Haritalama ve veri entegrasyonu, aynı zamanda, birincil dokularda karşılık gelen varyasyonlar için bir model olarak organoidlerden yararlanılmasıyla, bireyler arasındaki normal varyasyonun (örneğin, ortak genetik farklılıklardan dolayı) etkileşimli bir şekilde araştırılmasına da izin verecektir. Sonuç olarak Organoid Hücre Atlası’ndaki verilerin mümkün olan en yüksek kalitede ve yeniden üretilebilir olmasını sağlamak için birkaç tamamlayıcı strateji izlenecektir. İlk olarak, organoid üretmek için deneysel iş akışlarının standardizasyonuna ve doğrulanmasına yatırım yapılacaktır (örneğin, alternatif protokolleri karşılaştırarak ve teknik ve biyolojik faktörlerin kolon ve beyin organoidlerinin tek hücre profilleri üzerindeki göreceli etkisini değerlendirilmesi). İkinci olarak, HCA’nın veri işleme ve verilerin açıklanarak topluluk standartlarında paylaşılması ve elde edilen verilerden bir yazılım altyapısı oluşturma çabalarına katkıda bulunacaktır (örneğin, organoidler için belirli meta veri yapısıyla uyumluluğu sağlanarak). Üçüncüsü, hücrelerin organoidler ve karşılık geldiği primer dokular arasında esnek hizalanma ve karşılaştırılması için hesaplama yöntemleri geliştirilecek ve elde edilen veriler sistem üzerinden doğrulanabilecektir.
AB H2020 HCA | Organoid projesinin daha geniş ve çeşitli bilimsel topluluklar için faydalı ve etkisi en üst düzeye çıkarılmış olması için; tek hücreli profiller, HCA’nın veri paylaşımına, yerel etik düzenlemelerden geçirilip veri koruma yasasına uygun bir şekilde geliştirilip Avrupa’nın vermiş olduğu desteklere karşılık uygun olabildiğince hızlı bir şekilde halka açılacaktır. Yeni kurulan organoidler, Hubrecht Organoid Technology (kolon) aracılığıyla ‘yaşayan bir biyobank’ olarak ya da biyobank olarak indüklenmiş pluripotent kök hücre hatlarından (beyin) üretme için bir dizi kesin protokole olanak sağlanacaktır. Ayrıca, tek hücreli transkriptom okuması (CROP-seq) ile CRISPR uygulamasını takip eden, bir dizi hastalık merkezli pilot çalışmada Organoid Hücre Atlası’nın pratik faydası değerlendirilecek ve keşfedecektir. Organoid Hücre Atlasından seçilen beyin organoidleri kullanılarak genetik epilepsinin hastalık modellemesi elde edilebilir. Son olarak, Organoid Hücre Atlas Portalı’nın; insan organoidlerinden alınan tek hücre verilerinin sistemde taranabilmesi, bu verilere erişilebilmesi, analiz edilmesi ve yorumlanabilmesi için halka açık, sürdürülebilir ve yaygın olarak kullanılan bir altyapıya dönüştürmesi planlanıyor.
Gelecekteki Yönelik Planlar
Son teknolojik gelişmelerle birlikte gittikçe önemli bir hal alan yeni biyolojik yöntemlerin keşfi ve terapötik stratejilerin geliştirilmesi için “insan” önde gelen bir ‘model organizma’ haline geliyor. HCA, ilk kez insan vücudunun ayrıntılı bir moleküler resmini sunarak, tüm insan hücrelerinin referans haritalarını oluşturarak bu paradigma değişimini katalize etmekte. Organoidler gibi in vitro modeller, araştırmacıların insanın biyolojik sistemlerini işlevsel olarak incelemelerine ve sistematik olarak bozmalarına olanak sağlayarak bu araştırılan konularda büyük bir tamamlama sunacaktır. HCA bağlamında, AB H2020 HCA | Organoid projesi, Organoid Hücre Atlası’nın iki yıl içinde pratik olarak kullanışlı ve kolayca genişletilebilir bir ilk versiyonunu kullanıma sunmayı planlamakta. Bu projenin geliştirilebilmesi için Organoid Hücrenin etkisini en üst düzeye çıkarmak adına kapsamlı, daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulacaktır. Temel biyoloji ve biyomedikal uygulamalar için geliştirilen bu atlasın (Organoid Hücre Atlası) misyonu, nadir görülen genetik hastalıklar, karmaşık çok faktörlü hastalıklar ve hassas onkoloji gibi alanlarda hastalık merkezli araştırmaların desteklenerek ve hızlandırılarak biyomedikal keşfinin ve rejeneratif tedavilerin geliştirilmesinin ilerletilmesini kapamaktadır. Bu kapsayıcı hedef, geniş bir ilgili araştırmacı yelpazesi altında işbirliğini kolaylaştıran, toplulukları birleştiren ve organoidleri tek hücre teknolojisinden elde edilen uzmanlık ile entegre eden açık ve kapsayıcı bir araştırma ortamı oluşturarak gerçekleştirilebilir.
Kaynak: nature.com
