CRISPR, Daha Büyük Gen Düzenlemelerine Olanak Sağlayan Pac-Man ile Buluşuyor

UC San Francisco araştırmacılarının yeni çalışmasına göre; yeni tedavilerin geliştirilmesi ve insanlarda ya da diğer organizmalarda normal fonksiyonlara ek olarak hastalıkların da araştırılması adına DNA zincirini yeni bir teknik ile keserek gerçekleştirilen gen düzenlenmesi daha etkili bir sonuç verebilir.

Araştırma, genetik makas olarak bilinen CRISPR-Cas9 enzimini ilk kere kullanan iki araştırmacının Kimya dalında Nobel Ödülü almasından sadece iki hafta sonra Nature Methods dergisinde yayımlanmıştır.

CRISPR’ın şu anda Dünya çapında bir araştırma aracı olarak kullanılması bir tarafa, bakterilerde çağlar önce evrilmiş bir araçtır. Bakterilerin en eski düşmanı olan ve bakteriyofaj olarak bilinen tüm virüs türlerine karşı bir savunma aracıdır CRISPR. Bakteriler bir fajla karşılaştıkları zaman, viral DNA’nın bir kısmını kendi DNA’larına eklemektedirler ve daha sonra bu DNA parçası sayesinde ilgili RNA’yı sentezlemekte ve viral DNA’yı bağlayarak etkisiz hâle getirmekledirler. CRISPR enzimleri ise fajı hedefleyerek yok etmektedirler.

UCSF Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü’nde araştırmacı olan Doç. Dr. Joseph Bondy-Denomy, bu eski ve ilgi çekici silahlanma yarışını araştıran son çalışmasında, yeni bir CRISPR tekniği geliştirmek ve test etmek adına Dr. Bálint Csörgő ve Lina León ile birlikte çalışmıştır.

CRISPR-Cas9, hedeflenen bir bölgede küçük bir DNA parçasını hızlı ve hassas bir biçimde çıkartmak için kullanılabilen moleküler bir makas gibidir. Daha sonra yeni DNA parçası eklemek için farklı yöntemler de kullanılabilmektedir. Ancak UCSF araştırmacıları tarafından uyarlanan yeni CRISPR-Cas3 sistemi, farklı bir bakteriyel bağışıklık sistemi kullanmaktadır. Bu sistemdeki asıl enzim olan Cas3, çok daha uzun DNA bölgelerini hızlı ve doğru bir şekilde zincirden çıkartmak için moleküler bir testere gibi davranmaktadır.

Bondy-Denomy “Cas3 proteini, motorlu bir Cas9 proteini gibidir. İlgili DNA bölgesini bulduktan sonra, onu bir Pac-Man gibi çiğnemektedir,” demiştir.

Bondy-Denomy’e göre, uzun DNA bölgelerini ortadan kaldırmak ya da değiştirmek için kullanılabilecek bu yeni teknik, araştırmacıların, insanları ve insanlara etki edebilen patojenleri anlamada önemli bir husus olan fonksiyonu tam olarak anlaşılamamış DNA dizilerini içeren genomik bölgelerin önemini daha verimli bir şekilde değerlendirmelerini sağlayacaktır.

Bondy-Denomy “Daha önce, araştırma veya tedavi amacı ile bakterilerdeki çok büyük DNA bölgelerini silmenin kolay ve güvenilir bir yolu yok idi. Şimdi ise 100 farklı küçük DNA delesyonu gerçekleştirmek yerine, sadece bir tek silme işlemi yaparak neyin değiştiğini bulabiliri. …Bakterilerin ve diğer hücre türlerinin çoğunluk ile küçük moleküllü veya protein bazlı ilaçlar üretmek için kullanılmasından ötürü, CRISPR-Cas3, biyoteknoloji endüstrisi araştırmacılarının bu hücrelerden potansiyel olarak patojenik veya işe yaramaz DNA parçalarını daha kolay çıkartmalarını sağlayacaktır. …Bakteriyel DNA’nın büyük bir bölümü, hayatta kalmaları için gerekli olmadığı düşünülen ve bilinmeyen işlevleri olduğundan tam olarak anlaşılamamıştır. Buna ek olarak, bakteriyel DNA, dışardan elde ettiği ve insanlarda hastalığa neden olabilen veya bakteriyel metabolizmayı değiştirebilen büyük DNA parçalarını içermektedir,” demiştir.

Bondy-Denomy’e göre, CRISPR-Cas3 enzimi, endüstriyel, tarımsal ve hatta insan gen terapisi gibi uygulamalarda istenilen tüm genlerin genoma eklenmesi için de kullanılabilmektedir.

UCSF araştırmacıları, Pseudomonas aeruginosa bakterisinde bulunan CRISPR-Cas3 sistemini seçmiş ve üzerinde gerekli düzenlemelerde bulunmuşlardır. Bu ve bunun ile birlikte, insanlarda ve bitkilerde hastalıklara yol açabilen farklı üç tür bakteride daha bulunan bağışıklık sisteminin, belirlenen DNA bölgesini daha iyi kesebildiğini göstermişlerdir. Bondy-Denomy, diğer CRISPR-Cas3 sistemlerinin insanda ve diğer memeli canlılar üzerinde çalışmak üzere geliştirildiğini ve aynı durumun modifiye edilmiş P. Aeruginosa bağışıklık sistemi için de geçerli olduğunu belirmiştir.

Bondy-Denomy, yararlı moleküler araçlar geliştirebilmek ve bunların nasıl çalıştıkları hakkında daha fazla bilgi edinebilmek adına birçok bakteri türü, bakteriyofaj türü ve CRISPR sistemi üzerinde çalışmaktadır. Bondy-Denomy “CRISPR-Cas3, doğada bulunan en yaygın CRISPR sistemidir. Cas9 sistemini kullanan bakteri türlerinin yaklaşık 10 katı kadarı Cas3 sistemi kullanmaktadır. Cas3, faj DNA’sını parçaladığı için daha iyi bir bakteriyel bağışıklık sistemi sayılabilir,” demiştir.

Cas9’un aksine Cas3, ilgili DNA bölgesine bağlandığında çift sarmallı DNA’nın her bir sarmalını iki yönde de çiğnemeye (parçalamaya) başlamaktadır. UCSF deneylerinde elde edilen delesyonlar, kimi zaman 100 bakteri genini kapsayacak büyüklükte olmuştur. Araştırmacılar, CRISPR-Cas3 mekanizması ile ortadan kaldırılmış DNA bölgesinin yeni bir DNA dizisi ile daha kolay değiştirilebildiğini kanıtlamışlardır.

Araştırmacılar laboratuvar ortamında DNA düzenlemesini gerçekleştirebilmek için CRISPR sistemini, bir organizmada bulunan spesifik DNA dizilerini hedeflemek üzere seçtikleri herhangi bir rehber diziyi kullanarak programlamaktadırlar.

Yeni CRISPR-Cas3 çalışmasında görev alan araştırmacılar, CRISPR-Cas9 ile başaramadıkları büyük DNA onarımlarını gerçekleştirebilmişlerdir.

Bondy-Denomy, fajın bakterilere karşı savaşmak için evrimleştiği anti-CRISPR stratejilerini daha önceden keşfetmiştir ve bunların yan etkiler ortaya çıkmadan önce insan tedavilerinde kullanılan Cas enzimlerince gerçekleşen gen düzenleme reaksiyonlarını durdurmak için ya da bağırsaklarda bulunan istenmeyen bakterileri yok etmek için faj kullanımında yararlı olabileceğini belirtmiştir. E. coli ve diğer birkaç tür dışında, bağırsaklarda bulunan 1000 kadar bakteri türü hakkında az şey bilinmektedir.

Bondy-Denomy “Model olarak kullanılmayan mikroplar, genetik dünyada büyük ölçüde göz ardı edilmiştir ve onları incelemek için yeni araçlara büyük bir ihtiyaç vardır,” demiştir.

Makaleyi görüntülemek için “Hedeflenen Genom Mühendisliği için Etkili Bir Cascade – Cas3 Sistemi” buraya tıklayın.

Kaynak: phys.org