Hücre Dışında Hidrojen Peroksit Miktarını Ölçebilen Bir Biyosensör Geliştirildi!
Fotoğraf : Plazma membran bağlantılı nanosensörün açıklayıcı şeması. Altın nanopartiküller (AuNP) bağlanımı için kullanılan bileşikler, H2O2‘ye duyarlı 4-merkapto fenil boronik pinakol ester (4MPBE) ve Biyotin-HPDP’dir. Plazma membran proteini dış alanlarının biyotinlenmesi, NHS-Biyotin kullanılarak elde edilir. Konjuge AuNP ve NHS-Biyotin’in bağlanması, iki biyotin kısmı ile reaksiyona giren Streptavidin proteini tarafından sağlanır. (b) AFM (Atomik Kuvvet Mikroskobu) analizi, nanosensör sabitleme ve sabitlemeden sonra akciğer kanseri A549 hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Yüksek çözünürlüklü AFM görüntüleri, hücre yüzeyi ile temas halinde olan ve plazma membranı ile temas halindeki hücre dışı sıvının çok yüzeysel bir bölgesinde (90 nm) hücre içinde meydana gelen H2O2‘yi tespit edebilen nanosensörün varlığını doğruladı.
Kanazawa Üniversitesi’ndeki araştırmacılar, hücre zarı yakınındaki hidrojen peroksit miktarını ölçmek için bir sensörün başarılı denemesini Biosensors and Bioelectronics Dergisi’nde bildirdiler. Bu sensör, kanser tedavileri için kullanılacak yeni bir araç haline gelme gücüne sahiptir.
İnsan vücundaki birçok proses, hidrojen peroksit (H2O2) içeren biyokimyasal reaksiyonlar tarafından düzenlenir. Hücreler arasındaki belirli sinyalleri ileten veya güçlendiren “ikincil mesajcı” olarak görev almasına rağmen H2O2, oksidant (yükseltgen) özelliğinden dolayı genellikle çok zararlıdır. Bir diğer görevi protein ve DNA gibi biyokimyasal molekülleri oksitlemektir. H2O2’nin oksitleyici özelliği kanser için tedavi edici potansiyeldedir, kasıtlı olarak tümör hücrelerinin H2O2 konsantrasyonlarını arttırmalarına neden olmak onları yok etmenin bir yolu olacaktır.
Bunun ışığında, hücre dışı ortamındaki hidrojen peroksit miktarının eksiksiz biçimde belirlenmesi, aynı zamanda H2O2’nin aşırı üretimi ile ilişkili patolojileri gözlemlemek için çok önemlidir. Bu günlerde, Kanazawa Üniversite Nano Yaşam Bilimleri Enstitüsü’nden Leonardo Puppulin ve çalışma arkadaşları; nanometre çözünürlükte hücre zarı çevresindeki H2O2 miktarının belirlenmesi için bir sensör geliştirdiler.
Bu biyosensör, kendisine bağlanan organik moleküller bulunan bir nanoparçacıktan oluşuyor. Tüm yapı, hidrojen peroksit moleküllerinin tam olarak belirlendiği hücre membranın dışına kolayca tutturulmak için tasarlandı. Bilim insanları bağlanma molekülleri olarak, güçlü Raman saçılması karşılığı veren 4MPBE olarak adlandırılan bir bileşik kullandılar, bu moleküller bir lazerle ışınlandığında lazer ışığının enerjisinin bir kısmını tüketirler. Lazer ışığındaki değişimin frekansını hesaplayarak ve bu değişimin bir fonksiyonu olan sinyal gücünün grafiğini oluşturarak, 4MPBE moleküllerinin kendine özgü bir spektrumu belirlendi. Bir 4MPBE molekülü, H2O2 molekülüyle etkileştiği zaman, Raman spektrumu değişir. Bu prensibe dayanarak yani Raman spektrumlarını karşılaştırarak, Puppulin ve çalışma arkadaşları biyosensör yakınındaki H2O2 konsantrasyonu için tahmini bir ölçüm yapabildiler.
Fotoğraf : (a) Hücrelere sabitlenmiş nanosensörün altın yüzeyinde toplanan 4MPBE moleküllerinin H2O2 ile uyarılan değişimini belirlemek ve ölçmek için yüzeyi arttırılmış Raman spektroskopisi kullanıldı. Raman bandının 998 cm-1’deki yoğunluğu H2O2 konsantrasyonuna bağlıdır, 1074 cm-1’deki bant değişiklik göstermedi ve spektral çizgilerin normalizasyonu için kullanılabilir. (B) Nanosensör kalibrasyonunun sonuçları. 1074 cm-1’deki yoğunluğun 998 cm-1’deki yoğunluğa oranı, H2O2 konsantrasyonuna göre doğrusal bir bağımlılık göstermiştir. (C) Parlak alan görüntüsünde gösterilen A549 hücresinin yüzeyinden toplanan hücre dışındaki, hücre içinden kaynaklanan H2O2’nin SERS (Yüzeyi Arttırılmış Raman Spektroskopisi) hiperspektral görüntüleme örneği. (a) ‘da gösterilen SERS spektrumları A ve B bölgelerinden toplanmıştır.
H2O2 konsantrasyonunu Raman spektrumundaki bir değişiklikle kantitatif bir şekilde ilişkilendirmenin kolay olmamasına rağmen araştırmacılar, nanosensörleri için kalibrasyon aşaması geliştirdiler ve sonra, akciğer kanser hücresi örneği için yaklaşık 700 nm çözünürlükte bir konsantrasyon haritası oluşturabildiler. Son olarak, tekniklerini hücre zarları boyunca H2O2 konsantrasyon değişiminin ölçümlerini elde edecek şekilde geliştirmeyi de başardılar.
Puppulin ve çalışma arkadaşları, “Yeni yaklaşımlarının, fizyolojik süreçleri tam olarak aydınlatmak ve yeni terapötik stratejiler tasarlamak için önemli, hücre çoğalmasına veya ölümüne neden olan gerçek H2O2 konsantrasyonlarının incelenmesi için faydalı olabileceği” sonucuna varmışlardır.
Fotoğraf : (a) NOX kompleksi tarafından H2O2‘nin hücre dışı üretiminin, su kanalı yoluyla sonuçta emiliminin ve hücre içi peroksiredoksin ile reaksiyonun açıklayıcı şeması. Kararlı durum koşulunda, hücre dışı H2O2‘nin hücre içi H2O2‘ye konsantrasyon oranı; peroksiredoksin (kprx) ile H2O2 indirgemesinin hız sabitinin plazma membranı (kabs) yoluyla, H2O2 emiliminin hız sabitine oranıyla tahmin edilebilir. (b) – (c) Sırasıyla kabs ve kprx’i ölçtüğümüz mekanizma yöntemiyle yükseltgenme-indirgenme biyoloji deneylerinin özgün sonuçları. (d) Ortalama hücre dışı yüzeyindeki H2O2 konsantrasyonu ve yeni tasarlanmış nanosensör kullanılarak A549 hücrelerinde ölçülen ayırt edici maksimum H2O2 konsantrasyonu. (e) Ortalama hücre içi H2O2 konsantrasyonu ve (a) ‘da bildirilen modele göre ve (b) – (d)’ den elde edilen sonuçlar kullanılarak A549 hücreleri üzerinde tahmin edilen ayırt edici maksimum H2O2 konsantrasyonu.
Kanazawa Üniversitesi’nden Leonardo Puppulin ve çalışma arkadaşları tarafından geliştirilen biyosensör, yüzeyi arttırılmış Raman spektroskopisi (SERS) olarak adlandırılan metoda dayanır. Prensip, bir örneğe ışınlanan lazer ışığının gelen ve çıkan frekansları arasındaki farklılıkların analiz edildiği Raman spektroskopisinden elde edilmektedir. Sinyal gücünün frekans farkının bir fonksiyonu olarak çizilmesiyle elde edilen spektrum, prensipte tek bir molekül olabilen örnek için ayırt edicidir.
Genellikle, bir molekülden gelen sinyal tespit edilemeyecek kadar zayıftır; ancak molekül, pürüzlü bir metal yüzey üzerinde emildiğinde bu etki arttırılabilir. Puppulin ve çalışma arkadaşları bu tekniği, hidrojen peroksiti tespit etmek için dolaylı olarak uyguladılar; Raman’a duyarlı molekülleri, hidrojen peroksite maruz bırakıldığında değişime uğrayan 4MPBE adlı bir bileşiktir.
Kaynak : phys.org
